Wie Lichtmikroskope Funktionieren

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Das menschliche auge vermisst viel - betreten sie die unglaubliche welt der mikroskopie! Erfahren sie, wie ein lichtmikroskop funktioniert.

Seit ihrer Erfindung im späten 16. Jahrhundert haben Lichtmikroskope unser Wissen in den Bereichen Grundlagenbiologie, biomedizinische Forschung, medizinische Diagnostik und Materialwissenschaft erweitert. Lichtmikroskope können Objekte bis zu 1.000-fach vergrößern, wodurch mikroskopische Details sichtbar werden. Die Lichtmikroskopietechnologie hat sich weit über die ersten Mikroskope von Wachs hinaus entwickelt Robert Hooke und Antoni van Leeuwenhoek. Spezielle Techniken und Optiken wurden entwickelt, um die Strukturen und die Biochemie lebender Zellen aufzuzeigen. Mikroskope sind sogar in das digitale Zeitalter eingetreten, indem sie ladungsgekoppelte Geräte (CCDs) und Digitalkameras verwenden, um Bilder aufzunehmen. Die Grundprinzipien dieser fortschrittlichen Mikroskope ähneln jedoch denen des Studentenmikroskops, das Sie möglicherweise in Ihrem ersten Biologieunterricht verwendet haben.

In dieser Ausgabe von Wie Dinge funktionierenWir werden in die winzige Welt der Lichtmikroskope eintauchen und die verschiedenen Technologien untersuchen, mit denen sie zeigen können, was für das menschliche Auge sonst nicht nachweisbar ist.

Die Grundlagen

Diagramm eines typischen Schülerlichtmikroskops, das die Teile und den Lichtweg zeigt

Diagramm eines typischen Schülerlichtmikroskops, das die Teile und den Lichtweg zeigt

Ein Lichtmikroskop funktioniert ähnlich wie ein Brechungsfernrohr, jedoch mit einigen geringfügigen Unterschieden. Schauen wir uns kurz an, wie ein Teleskop funktioniert.

Ein Teleskop muss große Mengen Licht von einem schwachen, entfernten Objekt aufnehmen. deshalb braucht es eine große Objektivlinse um möglichst viel Licht zu sammeln und auf einen hellen Fokus zu bringen. Da die Objektivlinse groß ist, wird das Bild des Objekts in einiger Entfernung scharf gestellt, weshalb Teleskope viel länger sind als Mikroskope. Das Okular des Teleskops vergrößert dann das Bild, während es es Ihnen ins Auge bringt.

Im Gegensatz zu einem Teleskop muss ein Mikroskop Licht aus einem winzigen Bereich eines dünnen, gut beleuchteten Objekts sammeln, das sich in der Nähe befindet. Das Mikroskop benötigt also kein großes Objektiv. Stattdessen ist die Objektivlinse eines Mikroskops klein und sphärisch, was bedeutet, dass sie auf beiden Seiten eine viel kürzere Brennweite hat. Dadurch wird das Bild des Objekts aus kurzer Entfernung in der Röhre des Mikroskops scharfgestellt. Das Bild wird dann durch eine zweite Linse, eine sogenannte, vergrößert Okularlinse oder Okularwie es dir ins Auge gebracht wird.

Der andere Hauptunterschied zwischen einem Teleskop und einem Mikroskop besteht darin, dass ein Mikroskop eine Lichtquelle und ein Kondensator. Der Kondensor ist ein Linsensystem, das das Licht von der Quelle auf einen winzigen, hellen Fleck der Probe fokussiert. Dies ist derselbe Bereich, den die Objektivlinse untersucht.

Im Gegensatz zu einem Teleskop, das eine feststehende Objektivlinse und austauschbare Okulare aufweist, haben Mikroskope typischerweise austauschbare Objektivlinsen und feststehende Okulare. Durch das Wechseln der Objektivlinsen (von relativ flachen Objektiven mit niedriger Vergrößerung zu runderen Objektiven mit hoher Vergrößerung) kann ein Mikroskop immer kleinere Bereiche in Sichtweite bringen - Lichtsammlung ist nicht die Hauptaufgabe der Objektivlinse eines Mikroskops ist ein Teleskop.

Wir werden uns später im Artikel mit den Teilen eines Mikroskops näher befassen.

Machen Sie ein einfaches Mikroskop

Sie können ein einfaches Mikroskop erstellen, indem Sie Lupen und Papier verwenden:

  1. Holen Sie sich zwei Lupen und ein Blatt bedrucktes Papier.
  2. Halten Sie eine Lupe ein kleines Stück über das Papier. Das Druckbild wird etwas größer.
  3. Platzieren Sie die zweite Lupe zwischen Ihrem Auge und der ersten Lupe.
  4. Bewegen Sie das zweite Glas nach oben oder unten, bis der Druck scharf erscheint. Sie werden feststellen, dass der Ausdruck größer erscheint als in der ersten Lupe.

Sie können auch ein einfaches Lochmikroskop erstellen, das wie eine Lochkamera funktioniert. Einzelheiten finden Sie unter TOPScopes.

Bildqualität

Bild des Pollenkorns bei guter Helligkeit (links) und schlechter Helligkeit (rechts)

Bild des Pollenkorns bei guter Helligkeit (links) und schlechter Helligkeit (rechts)

Wenn Sie eine Probe mit einem Mikroskop betrachten, wird die Qualität des Bildes, das Sie sehen, wie folgt beurteilt:

  • Helligkeit - Wie hell oder dunkel ist das Bild? Die Helligkeit bezieht sich auf das Beleuchtungssystem und kann geändert werden, indem die Spannung der Lampe (Rheostat) geändert wird und die Kondensor- und Membran- / Lochblendenöffnungen angepasst werden. Helligkeit steht auch im Zusammenhang mit numerische Apertur des Objektivs (je größer die numerische Blende, desto heller das Bild).
  • Fokus - Ist das Bild verschwommen oder klar definiert? Der Fokus bezieht sich auf Brennweite und kann mit den Fokusknöpfen gesteuert werden. Die Dicke des Deckglases auf dem Objektträger kann sich auch auf die Fokussierbarkeit des Bilds auswirken - es kann für die Objektivlinse zu dick sein. Die korrekte Deckglasstärke ist auf der Seite der Objektivlinse angegeben.

Wie Lichtmikroskope funktionieren: lichtmikroskope

Bild des Pollenkorns im Fokus (links) und unscharf (rechts)
  • Auflösung - Wie nahe können zwei Punkte im Bild sein, bevor sie nicht mehr als zwei getrennte Punkte betrachtet werden? Die Auflösung bezieht sich auf die numerische Apertur der Objektivlinse (je höher die numerische Apertur, desto besser die Auflösung) und die Wellenlänge des durch die Linse tretenden Lichts (je kürzer die Wellenlänge, desto besser die Auflösung).

Wie Lichtmikroskope funktionieren: funktionieren

Bild des Pollenkorns mit guter Auflösung (links) und schlechter Auflösung (rechts)
  • Kontrast - Was ist der Unterschied in der Beleuchtung zwischen benachbarten Bereichen der Probe? Der Kontrast bezieht sich auf das Beleuchtungssystem und kann durch Ändern der Lichtintensität und der Blende / Lochblende eingestellt werden. Auch chemische Flecken, die auf die Probe aufgetragen werden, können den Kontrast verbessern.

Wie Lichtmikroskope funktionieren: lichtmikroskope

Bild von Pollenkorn mit gutem Kontrast (links) und schlechtem Kontrast (rechts)

Im nächsten Abschnitt werden wir über die verschiedenen Arten der Mikroskopie sprechen.

Arten der Mikroskopie

Lichtweg eines Phasenkontrastmikroskops

Lichtweg eines Phasenkontrastmikroskops

Ein Hauptproblem bei der Beobachtung von Proben unter einem Mikroskop besteht darin, dass ihre Bilder nicht viel Kontrast haben. Dies gilt insbesondere für Lebewesen (z. B. Zellen), obwohl natürliche Pigmente, wie das grüne Blatt, einen guten Kontrast bieten. Eine Möglichkeit zur Verbesserung des Kontrastes besteht darin, die Probe mit Farbpigmenten oder Farbstoffen zu behandeln, die an bestimmte Strukturen innerhalb der Probe binden. Es wurden verschiedene Arten von Mikroskopien entwickelt, um den Kontrast in Proben zu verbessern. Die Spezialisierungen betreffen hauptsächlich die Beleuchtungssysteme und die Lichtarten, die durch den Prüfling geleitet werden. Beispielsweise verwendet ein Dunkelfeldmikroskop einen speziellen Kondensor, um das meiste des hellen Lichts auszublenden und die Probe mit schrägem Licht zu beleuchten, ähnlich wie der Mond das Sonnenlicht in einer Sonnenfinsternis blockiert. Diese optische Anordnung bietet einen vollständig dunklen Hintergrund und erhöht den Kontrast des Bildes, um feine Details hervorzuheben - helle Bereiche an den Grenzen der Probe.

Hier sind die verschiedenen Arten von Lichtmikroskopie-Techniken:

  • Hellfeld - Dies ist die grundlegende Mikroskopkonfiguration (die bisher gesehenen Bilder stammen alle von Hellfeldmikroskopen). Diese Technik hat sehr wenig Kontrast; In den Bildern, die Sie bisher gesehen haben, wurde ein Großteil des Kontrasts durch Anfärben der Proben erzielt.
  • Dunkles Feld - Diese Konfiguration verbessert den Kontrast, wie oben erwähnt. Einzelheiten und Beispiele finden Sie unter Molekulare Ausdrücke: Dunkelfeldmikroskopie.
  • Rheinberg-Beleuchtung - Dieser Aufbau ähnelt dem Dunkelfeld, verwendet jedoch eine Reihe von Filtern, um eine "optische Verfärbung" der Probe zu erzeugen. Einzelheiten und Beispiele finden Sie unter Molekulare Ausdrücke: Rheinberg-Beleuchtung.

Die folgenden Techniken verwenden dasselbe Grundprinzip wie die Rheinberg-Beleuchtung und erzielen unterschiedliche Ergebnisse, wenn unterschiedliche optische Komponenten verwendet werden. Die Grundidee besteht darin, den Lichtstrahl in zwei Wege zu teilen, die die Probe beleuchten. Lichtwellen, die durch dichte Strukturen innerhalb der Probe laufen, verlangsamen sich im Vergleich zu denen, die durch weniger dichte Strukturen gehen. Da alle Lichtwellen gesammelt und zum Okular übertragen werden, werden sie rekombiniert, sodass sie sich gegenseitig stören. Die Interferenzmuster bieten einen Kontrast: Sie können dunkle Bereiche (dichter) auf hellem Hintergrund (weniger dicht) anzeigen oder eine Art falsches dreidimensionales (3-D) Bild erzeugen.

  • Phasenkontrast - Diese Technik eignet sich am besten für das Betrachten lebender Exemplare wie kultivierte Zellen.

In einem Phasenkontrastmikroskop trennen die Ringringe in der Objektivlinse und im Kondensor das Licht. Das Licht, das durch den zentralen Teil des Lichtpfads fällt, wird mit dem Licht rekombiniert, das sich um den Umfang der Probe herum bewegt. Die durch diese beiden Pfade erzeugte Interferenz erzeugt Bilder, in denen die dichten Strukturen dunkler erscheinen als der Hintergrund. Einzelheiten und Beispiele finden Sie unter Molekulare Ausdrücke: Phasenkontrastmikroskopie.

Wie Lichtmikroskope funktionieren: funktionieren

Ein Phasenkontrastbild einer aus einem Rattengehirn kultivierten Gliazelle
  • Differenzieller Interferenzkontrast (DIC) - DIC verwendet Polarisationsfilter und Prismen, um die Lichtwege zu trennen und zu rekombinieren, wodurch der Probe ein 3D-Aussehen verliehen wird (DIC wird auch genannt) Nomarski nach dem Mann, der es erfunden hat). Einzelheiten und Beispiele finden Sie unter Molekulare Ausdrücke: Differentialinterferenzkontrastmikroskopie.
  • Hoffman Modulation Kontrast - Der Kontrast der Hoffman-Modulation ist dem DIC ähnlich, mit der Ausnahme, dass Platten mit kleinen Schlitzen sowohl in der Achse als auch in der Achse außerhalb des Lichtpfads verwendet werden, um zwei Sätze von Lichtwellen zu erzeugen, die durch die Probe laufen. Wieder wird ein 3D-Bild erzeugt. Einzelheiten und Beispiele finden Sie unter Molekulare Ausdrücke: Hoffman-Modulationskontrastmikroskopie.
  • Polarisation - Das Polarisationsmikroskop verwendet zwei Polarisatoren, eine auf beiden Seiten der Probe, die senkrecht zueinander positioniert sind, so dass nur Licht, das durch die Probe fällt, das Okular erreicht. Das Licht wird in einer Ebene polarisiert, wenn es den ersten Filter passiert und die Probe erreicht. Regelmäßig beabstandete, strukturierte oder kristalline Teile der Probe drehen das durchgelassene Licht. Ein Teil dieses gedrehten Lichts durchläuft den zweiten Polarisationsfilter, so dass diese regelmäßig beabstandeten Bereiche hell auf schwarzem Hintergrund erscheinen. Einzelheiten und Beispiele finden Sie unter Molekulare Ausdrücke: Einführung in die Polarisationsmikroskopie.
  • Fluoreszenz - Diese Art von Mikroskop verwendet hochenergetisches Licht mit kurzer Wellenlänge (normalerweise ultraviolettes Licht), um Elektronen in bestimmten Molekülen innerhalb einer Probe anzuregen, wodurch diese Elektronen zu höheren Umlaufbahnen verschoben werden. Wenn sie auf ihre ursprünglichen Energieniveaus zurückfallen, emittieren sie Licht mit niedrigerer Energie und längerer Wellenlänge (normalerweise im sichtbaren Spektrum), wodurch das Bild entsteht.

Im nächsten Abschnitt werden wir die Fluoreszenzmikroskopie detaillierter besprechen.

Probenvorbereitung

Bei der Beobachtung einer Probe durch durchgelassenes Licht muss Licht durch die Probe treten, um ein Bild zu erzeugen. Je dicker die Probe ist, desto weniger Licht fällt durch. Je weniger Licht durchtritt, desto dunkler wird das Bild. Daher müssen die Proben dünn sein (0,1 bis 0,5 mm). Viele lebende Exemplare müssen vor der Beobachtung in dünne Teile geschnitten werden.Proben von Gestein oder Halbleitern sind zu dick, um durch das durchgelassene Licht geschnitten und beobachtet zu werden, so dass sie von dem von ihren Oberflächen reflektierten Licht beobachtet werden.

Fluoreszenzmikroskopie

Lichtweg eines Epifluoreszenzmikroskops

Lichtweg eines Epifluoreszenzmikroskops

Ein Fluoreszenzmikroskop verwendet eine Quecksilber- oder Xenonlampe, um ultraviolettes Licht zu erzeugen. Das Licht fällt in das Mikroskop und trifft einen dichroitischer Spiegel - ein Spiegel, der einen Wellenlängenbereich reflektiert und einen anderen Bereich durchlässt. Der dichroitische Spiegel reflektiert das ultraviolette Licht bis zur Probe. Das ultraviolette Licht regt die Fluoreszenz innerhalb der Moleküle in der Probe an. Die Objektivlinse sammelt das erzeugte fluoreszierende Wellenlängenlicht. Dieses Fluoreszenzlicht tritt durch den dichroitischen Spiegel und ein Sperrfilter (das andere Wellenlängen als Fluoreszenz eliminiert) durch und gelangt so zum Okular, um das Bild zu erzeugen.

Die fluoreszierenden Moleküle in der Probe können entweder natürlich vorkommen oder eingeführt werden. Beispielsweise können Sie Zellen mit einem Farbstoff färben Calcein / AM. Dieser Farbstoff ist an sich nicht fluoreszierend. Der AM-Teil des Moleküls verbirgt einen Teil des Calcein-Moleküls, der Calcium bindet, das fluoresziert. Wenn Sie Calcein / AM mit der Lösung mischen, die die Zellen badet, gelangt der Farbstoff in die Zelle. Lebende Zellen besitzen ein Enzym, das den AM-Anteil entfernt, das Calcein in der Zelle einfängt und es dem Calcein ermöglicht, Calcium zu binden, so dass es unter ultraviolettem Licht grün fluoresziert. Tote Zellen haben dieses Enzym nicht mehr. Daher fluoreszieren lebende Zellen grün und tote Zellen fluoreszieren nicht. Sie können die toten Zellen in derselben Probe sehen, wenn Sie einen anderen Farbstoff namens Propidiumiodid einmischen, der nur die toten Zellen durchdringt. Propidiumjodid bindet an DNA im Kern und fluoresziert unter ultraviolettem Licht rot. Diese Zweifarbstoffmethode wird in toxikologischen Studien verwendet, um den Prozentsatz einer Zellpopulation zu bestimmen, der bei einer Behandlung mit einer Umweltchemikalie wie einem Pestizid getötet wird.

Wie Lichtmikroskope funktionieren: probe

Fluoreszenzbild kultivierter Rattenhirnzellen. Lebende Zellen färben sich mit Calcein (links) und tote Zellen mit Propidiumjodid (rechts).

Wie Lichtmikroskope funktionieren: werden

Fluoreszenzbild kultivierter Rattenhirnzellen. Lebende Zellen färben sich mit Calcein (links) und tote Zellen mit Propidiumjodid (rechts).

Fluoreszenzmikroskopie-Techniken sind nützlich, um Strukturen zu sehen und physiologische und biochemische Ereignisse in lebenden Zellen zu messen. Verschiedene fluoreszierende Indikatoren stehen zur Verfügung, um viele physiologisch wichtige Chemikalien wie DNA, Calcium, Magnesium, Natrium, pH-Wert und Enzyme zu untersuchen. Darüber hinaus können Antikörper, die für verschiedene biologische Moleküle spezifisch sind, chemisch an fluoreszierende Moleküle gebunden und zum Anfärben spezifischer Strukturen in Zellen verwendet werden. Einzelheiten und weitere Beispiele finden Sie unter Molekulare Ausdrücke: Fluoreszenzmikroskopie.

Im nächsten Abschnitt werden die Komponenten eines Lichtmikroskops und ihre Funktionen untersucht.

Epifluoreszenz

ist ein optischer Aufbau für ein Fluoreszenzmikroskop, bei dem die Objektivlinse sowohl zum Fokussieren von ultraviolettem Licht auf die Probe als auch zum Sammeln von Fluoreszenzlicht von der Probe verwendet wird. ist effizienter als übertragene Fluoreszenz, bei dem eine separate Linse oder ein Kondensor verwendet wird, um ultraviolettes Licht auf die Probe zu fokussieren. ermöglicht auch die Kombination der Fluoreszenzmikroskopie mit einem anderen Typ im selben Mikroskop.

Die Teile eines Lichtmikroskops

Ein Lichtmikroskop, ob ein einfaches Schülermikroskop oder ein komplexes Forschungsmikroskop, hat folgende Basissysteme:

  • Objektkontrolle - Halten Sie die Probe und manipulieren Sie sie Bühne - wo das Exemplar ruht Clips - Wird verwendet, um die Probe auf der Bühne zu halten (Da Sie ein vergrößertes Bild betrachten, können selbst kleinste Bewegungen der Probe Teile des Bildes aus Ihrem Blickfeld herausbewegen.) Mikromanipulator - Gerät, mit dem Sie die Probe in kontrollierten, kleinen Schritten entlang der x- und y-Achse bewegen können (nützlich zum Scannen eines Objektträgers)
  • Erleuchtung - Licht auf die Probe werfen (Das einfachste Beleuchtungssystem ist ein Spiegel, der das Raumlicht durch die Probe reflektiert.) Lampe - erzeugt das Licht (Typischerweise handelt es sich bei Lampen um Glühlampen aus Wolframfilamenten. Für spezielle Anwendungen können Quecksilber- oder Xenon-Lampen verwendet werden, um ultraviolettes Licht zu erzeugen. Einige Mikroskope verwenden sogar Laser, um die Probe abzutasten.) Rheostat - ändert den an die Lampe angelegten Strom, um die Intensität des erzeugten Lichts zu steuern Kondensator - Linsensystem, das das Licht der Lampe auf die Probe ausrichtet und fokussiert Membranen oder Lochblenden - im Lichtweg platziert, um die Lichtmenge zu verändern, die den Kondensor erreicht (zur Erhöhung des Kontrasts im Bild) Diagramm eines typischen Schülerlichtmikroskops, das die Teile und den Lichtweg zeigt
  • Linsen - Bild bilden Objektivlinse - sammelt Licht von der Probe Okular - überträgt und vergrößert das Bild vom Objektiv zum Auge Nasenstück - Drehbare Halterung, die viele Objektivlinsen hält Tube - hält das Okular im richtigen Abstand von der Objektivlinse und sperrt Streulicht aus
  • Fokus - Positionieren Sie die Objektivlinse im richtigen Abstand von der Probe Grobfokusknopf - wird verwendet, um das Objekt in die Brennebene der Objektivlinse zu bringen Feinfokusknopf - wird verwendet, um Feineinstellungen zum Scharfstellen des Bildes vorzunehmen
  • Unterstützung und Ausrichtung Arm - gekrümmter Abschnitt, der alle optischen Teile in einem festen Abstand hält und diese ausrichtet Base - unterstützt das Gewicht aller Mikroskopteile Tube ist mit dem verbunden Arm des Mikroskops über ein Zahnstangengetriebe.Mit diesem System können Sie das Bild scharfstellen, wenn Sie die Objektive oder den Beobachter wechseln, und die Objektive beim Austauschen der Proben von der Bühne wegbewegen.

Einige der oben genannten Teile sind nicht im Diagramm dargestellt und variieren je nach Mikroskop. Mikroskope sind in zwei Grundkonfigurationen erhältlich: stehend und invertiert. Das in der Abbildung dargestellte Mikroskop ist ein aufrechtes Mikroskop, die das Beleuchtungssystem unterhalb der Bühne und das Linsensystem oberhalb der Bühne hat. Ein umgekehrtes Mikroskop hat das Beleuchtungssystem über der Bühne und das Linsensystem unter der Bühne. Umgekehrte Mikroskope können besser durch dicke Proben wie z. B. Schalen von kultivierten Zellen blicken, da die Linsen näher an den Boden der Schale gelangen können, wo die Zellen wachsen.

Lichtmikroskope können Strukturen von lebenden Zellen und Geweben sowie von nicht lebenden Proben wie Gesteinen und Halbleitern aufzeigen. Mikroskope können ein einfaches oder komplexes Design aufweisen, und einige können mehr als eine Art von Mikroskopie durchführen, von denen jede etwas andere Informationen enthält. Das Lichtmikroskop hat unser biomedizinisches Wissen erheblich weiterentwickelt und ist nach wie vor ein starkes Werkzeug für Wissenschaftler.

Einige Mikroskopbegriffe
  • Tiefenschärfe - vertikaler Abstand von oberhalb bis unterhalb der Brennebene, der ein akzeptables Bild ergibt
  • Sichtfeld - Bereich der Probe, der mit einer gegebenen Objektivlinse durch das Mikroskop gesehen werden kann
  • Brennweite - Abstand, den eine Linse benötigt, um das Licht zu fokussieren (normalerweise in Mikrometer gemessen)
  • Schwerpunkt / Fokus - Punkt, an dem das Licht einer Linse zusammenkommt
  • Vergrößerung - Produkt der Vergrößerungsstärke der Objektiv- und Okularlinsen
  • Numerische Blende - Messung der Lichtsammelfähigkeit der Linse
  • Auflösung - Die nächsten zwei Objekte können sich befinden, bevor sie nicht mehr als separate Objekte erkannt werden (normalerweise in Nanometern gemessen).

Andere großartige Links

  • Mikroskope in Laborqualität

Allgemeine Information

  • Lichtmikroskop
  • UCLA Brain Research Institute Mikroskopische Kerneinrichtungen
  • TOPS-Lernsysteme: TOPScopes
  • PocketScope.com

Tutorials und virtuelle Mikroskope

  • MOLECULAR EXPRESSIONS: Die Welt der Optik und Mikroskopie erkunden
  • Nikon: MikroskopieU
  • Olympus Microscopy Resource Center

Organisationen, Bildungsinformationen, Branchenressourcen

  • Microscopy Society of America (MSA) Startseite
  • Microscopy Society of America: Projekt Mikro
  • MicroWorld: Ausgewählte Mikroskopieressourcen für die K-12-Ausbildung
  • 101Science.com: Mikroskope
  • MicroWorld: Leitfaden für Online-Mikroskopie und Mikroanalyse-Ressourcen
  • Mikroskopie-Online.com


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